一、流式細胞術

流式細胞術（Flow Cytometry，FCM）從字面意義理解，Flow—Fluid、Cyto—Cell、Metry—Measurement，是一種對液流中排成單列的細胞或其它生物微粒（如微球，細菌，小型模式生物等）逐個進行快速定量分析和分選的技術。其特點是通過快速測定庫爾特電阻、熒光、光散射和光吸收來定量測定細胞DNA含量、細胞體積、蛋白質(zhì)含量、酶活性、細胞膜受體和表面抗原等許多重要參數(shù)。根據(jù)這些參數(shù)將不同性質(zhì)的細胞分開，以獲得供生物學和醫(yī)學研究用的純細胞群體。

1.流式細胞術的關鍵優(yōu)勢：

高通量：一次實驗能夠分析數(shù)千至數(shù)百萬個細胞，幾秒內(nèi)完成大規(guī)模數(shù)據(jù)收集。

單細胞多參數(shù)分析：一次實驗可同時測量單個細胞的多個參數(shù)，如細胞大小、顆粒性、表面標志物和內(nèi)部復雜性。

數(shù)據(jù)精確度高：通過熒光信號與細胞大小等物理參數(shù)結合，提供精確的亞群分析。

2.核心應用：

免疫表型分析（Immunophenotyping）：通過熒光標記的抗體鑒定不同的免疫細胞亞群。

細胞周期分析：評估細胞群體的不同周期階段。

細胞凋亡檢測：通過標記凋亡相關分子檢測細胞凋亡情況。

細胞活力檢測：結合活細胞與死細胞染料，分析細胞活力狀態(tài)。

二、流式細胞術原理

1. 特定波長的激光束直接照射到高壓驅(qū)動的液流內(nèi)的細胞，產(chǎn)生的光信號被多個接收器所接收，包括激光束直線方向上接收到的散射光信號（前向角散射）和激光束垂直方向上接收到的光信號（散射光信號（側向角散射）和熒光信號）。液流中懸浮的直徑從0.2-150 μm的細胞或顆粒能夠使激光束發(fā)生散射，細胞上結合的熒光化合物被激光激發(fā)后能夠發(fā)射熒光。散射光信號和熒光信號被相應的接收器接收，根據(jù)接受到的信號的強弱從而反映每個細胞的物理學特征。

2. 熒光的原理 是流式細胞術中的核心。熒光分子（稱為熒光團，fluorophore）通過吸收外部光源（如激光）產(chǎn)生激發(fā)，隨后回到基態(tài)時發(fā)出熒光。這一發(fā)射光信號可被檢測，并用于標記不同的細胞組分，如細胞表面或內(nèi)部抗原。

3. 熒光過程的三個階段：

激發(fā)（Excitation）：熒光分子吸收激光能量，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)。

激發(fā)態(tài)壽命（Excited Lifetime）：熒光分子處于激發(fā)態(tài)的時間極短，通常為納秒級。

發(fā)射（Emission）：電子回到基態(tài)時釋放多余的能量，以較低能量的光子形式發(fā)射，波長比激發(fā)光更長。

4. 斯托克斯位移（Stokes Shift）：

斯托克斯位移是指激發(fā)光的波長與發(fā)射光波長之間的差異，發(fā)射光總是比激發(fā)光的波長長、能量低。這個位移是區(qū)分不同熒光染料發(fā)射信號的基礎。利用這種位移可以有效避免激發(fā)光與發(fā)射光的混淆。

5.熒光染料的選擇：

熒光染料是根據(jù)它們的激發(fā)波長和發(fā)射波長來選擇的。常見的熒光染料如Alexa Fluor系列、FITC、PE等，它們有不同的光譜特性，適用于不同的激光器配置。（Alexa Fluor 488 的激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為530 nm）

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